近日，我院应光国教授团队2021级硕士研究生李小佩等人在环境与生态领域顶级期刊《Environmental Science & Technology》上发表了题为“Toxicity and Estrogenicity of Bisphenol TMC in Oryzias melastigma via In Vivo and In Silico Studies”的研究性文章。该研究主要亮点是确定了双酚A替代物双酚TMC具有较高的生物风险和更好地解决了同源性不好蛋白建模问题。
图文摘要
引言
双酚类通常用作塑料等工业产品的添加剂。双酚A（BPA）是最常用的一种，但是由于BPA会对包括人类在内的生物体造成不良影响，已被禁止添加在奶瓶和吸管杯中，导致对其替代品的需求增加。双酚4-[1-（4-羟基苯基）-3,3,5-三甲基环己基]苯酚（BPTMC）是BPA的替代品之一。在不同的产品和环境介质中检测到BPTMC的存在，例如口罩、婴儿奶瓶、吸管杯、河水、污泥、房屋灰尘等。目前几篇关于BPTMC体外毒性研究发现，BPTMC具有一定的细胞毒性和内分泌干扰效应，并存在潜在的雌激素受体蛋白结合能力（Esr）。包括双酚类似物在内的环境雌激素通常与Esr相互作用，并触发生物体内分泌系统中的信号转导。分子对接已被用于验证环境雌激素的Esr结合模式。为了更好地评估雌激素和Esr蛋白之间的结合潜力，需要建立Esr蛋白的精准的三维（3D）结构。如果近同源序列（即斑马鱼Esrs）被鉴定，可以通过将靶序列与已鉴定的高度同源结构作为模板（即同源模型）进行比对来建立高分辨率同源模型。如果蛋白质数据库（PDB）库中没有近同源序列，则需要从头开始预测模型，即从头建模。例如，在PDB数据库中，海水青鳉Esr与其他Esr的序列同一性小于40%。因此，通过同源性建模获得的模型中可能存在大量的不确定区域。由于从头建模获得的结构需要长时间的平衡和分子动力学优化才能使蛋白质环区螺旋，这限制了其在生态毒理学研究中的应用。本研究的主要目的是全面评估BPTMC对海水青鳉胚胎和幼鱼的综合毒性（生长发育毒性、神经毒性、内分泌干扰效应），此外，通过从头建模建立了海水青鳉Esrs亚型的三维结构，并通过分子对接和分子力学-广义波恩表面积（MM-GBSA）分析了三种海水青鳉Esr亚型与BPTMC的结合位点和结合能。这项研究将有助于更好地了解BPTMC在鱼类中的雌激素和其他毒性。
成果简介
（1）不同浓度BPTMC具有不同程度的发育毒性、神经毒性和内分泌干扰效应。低浓度的BPTMC暴露会对海水青鳉的孵化率、心率、畸形率和运动行为产生刺激作用。然而，BPTMC浓度的升高会导致海水青鳉胚胎和幼鱼产生炎症反应和心率和运动行为的改变。同时，BPTMC改变了海水青鳉胚胎或/和幼鱼中雌激素受体、卵黄蛋白原和内源性17β-雌二醇的浓度，以及雌激素相关基因的转录水平（图1；图2）。
图1 暴露于BPTMC的海水青鳉胚胎和幼鱼的不同类型的畸形。（A） 在处理第七天时由BPTMC引起的胚胎色素沉着的减少，从左至右：溶剂对照组的胚胎，0.25-5 μg/L的BPTMC处理组的胚胎，100 μg/L的BPTMC处理组的胚胎，2000μg/L的BPTMC处理组的胚胎；（B） BPTMC处理第14天时引起的海水青鳉幼鱼畸形，ID：内部损伤（胆囊呈绿色，出血），SD：脊柱变形，PR：色素减少，YE：卵黄囊水肿，CF：颅面畸形，CD：尾鳍畸形。
图2 BPTMC对海水青鳉胚胎和幼鱼的雌激素作用。（A ）胚胎和幼鱼中的内源性E2水平；（B） 胚胎和幼鱼中的内源性11-KT水平；（C） 胚胎和幼鱼中的Esr蛋白水平；（D）胚胎和幼鱼中的VTG蛋白水平；（E） 胚胎中雌激素效应相关基因的转录水平；（F）幼鱼中雌激素效应相关基因的转录水平。
（2）通过对海水青鳉Esrs（Esr1，Esr2a，Esr2b）蛋白通过单模板同源建模、多模板同源建模、从头建模进行比较，在一个相对稳定的能量体系前提下通过ERRAT指数对三个不同建模方法得到结构进行比较，结果表明从头建模的模型的结果最好（图3）。
图3 海水青鳉Esrs的ERRAT评估结果。（A）Esr1的ERRAT结果；（B）Esr2的ERRAT结果；（C）Esr3的ERRAT结果。
（3）将从头建模得到的蛋白通过GROMACS进行能量最小化、能量平衡，最后进行50ns分子动力学优化，得到优化后蛋白质结构，对其进行质量评估，其中Esr1，Esr2a，Esr2b分别有97.6%、98.8%、99.6%结构落在允许区域（图4）。
图4 对海水青鳉Esr蛋白总体质量评估。（A）Esr1总体质量；（B）Esr2a整体质量；（C）Esr2b整体质量。
图5 BPTMC和海水青鳉Esr蛋白的结合位点。（A）BPTMC和Esr1蛋白的结合位点；（B）BPTMC和Esr2a蛋白的结合位点；（C）BPTMC和Esr2b的结合位点。
（4）优化后的蛋白质结构（Ers1，Esr2a，Esr2b）与BPTMC的三维结构在Schrödinger-Maestro12.8上进行分子对接，并通过MM-GBSA分析对其结合能进行计算，得到BPTMC和Esr1的Leu351、Gly299、Gly300和Gly303存在结合位点，与Esr2a的Gln418、Glu416和Glu328之间存在结合位点，和Esr2b的Gly380之间存在结合位点，BPTMC和Esr1、Esr2a、Ese2b的结合能分别为-47.23, -49.23, and -50.30 kj/mol（图5）。此外，计算了BPA与Esr1、Esr2a、Esr2b在相同位点的结合能。通过理论数据以及研究数据表明，BPTMC的内分泌干扰效应强于BPA。
全文链接
Li, X.P., Qiu, S.Q. Huang, G.Y., Lei, D.Q., Wang, C.S., Xie, L.T., Ying, G.G., 2023. Toxicity and Estrogenicity of Bisphenol TMC in Oryzias melastigma via In Vivo and In Silico Studies. Environmental Science & Technology 57, 3280−3290. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.2c08009